Esse método baseia-se no uso de um agente ligante específico e de hormônios radioativos como elementos traçadores, para medir a concentração de substâncias. Uma quantidade fixa de hormônio radioativo compete com o hormônio a ser medido (idêntico ao radioativo) por um número limitado (saturado) de locais de ligação de um agente ligante, como anticorpos, de alta afinidade e especificidade pelo hormônio a ser mensurado. Os antígenos marcados livres e os ligados ao anticorpo devem, então, ser separados por centrifugação e/ou decantação, antes de mensurar a radioatividade dos radioisótopos ligados. A concentração de antígeno nas amostras testadas é inversamente proporcional à quantidade de radioatividade na fração ligados.

Alguns ensaios hormonais utilizam dois anticorpos, um ligado à fase sólida e o outro marcado com alguma substância geradora de sinal, sendo o mais utilizado o 1125 , OS quais se ligam ao hormônio em estudo. Esse ensaio não competitivo e diretamente proporcional é conhecido como imunorradiométrico (IRMA).

A concentração de determinado hormônio pode ser determinada em amostras de fluidos ou extratos biológicos (p. ex., soro, plasma, saliva, fezes, urina, pelos, entre outros).

As vantagens em se dosar por RIE são a alta sensibilidade para detectar antígenos em concentrações muito pequenas, picomolares ou inferiores. A maioria dos conjuntos diagnósticos comerciais (kits) disponíveis no mercado foi desenvolvida para avaliação quantitativa de hormônios no soro humano, sendo necessária a validação desses kits de alta especificidade para o uso em veterinária, assim como qualquer outro imunoensaio que utilize anticorpos desenvolvidos para dosagem na espécie humana.

O RIE utiliza o radioisótopo |¹²⁵ , que requer licença especial na Comissão Nacional de Energia Nuclear (CNEN), o órgão regulador. São necessárias também instalações adequadas para sua manipulação e descarte.

O método de quimioluminescência baseia-se em um fenômeno pelo qual se obtém energia luminosa a partir de uma reação química. Esse imunoensaio utiliza um sistema fundamentado em unidades teste, recoberto com anticorpo específico, como ensaio em fase sólida, servindo como recipiente para a reação imune, a incubação, a lavagem e o desenvolvimento do sinal luminoso. A emissão de luz do substrato quimioluminescente reagindo com o conjugado enzimático é proporcional à quantidade de substâncias a serem analisadas. Há, porém, casos nos quais a análise é feita de maneira indireta, isto é, o analito participa da geração ou do consumo da reação química.

Essa técnica tem como vantagens a praticidade de execução e a menor variação durante a pipetagem, pois o técnico só precisa acrescentar a amostra nos tubos, sendo os demais reagentes adicionados pelo próprio equipamento.

No cenário atual, é um dos métodos onde percebemos um alto investimento das empresas no mercado voltado para a medicina humana, refletindo também para nossa área de atuação, então podemos inferir que somos beneficiados paralelamente.

É importante ressaltar que há uma diferença de valores e performance entre os equipamentos como os mais usados Immulite®1000 e o Immulite®2000, entre outras marcas, sendo necessário ser reportado ao clínico exatamente qual o modelo e fabricante aplicado no laboratório que está gerando aqueles resultados.

A espectrometria de massa (MS) baseia-se na detecção e diferenciação de analitos através das massas características de cada composto ou classe de compostos. Para tanto, o MS converte as moléculas alvo em íons de fase gasosa através da transmissão de uma carga elétrica. O fluxo resultante de íons eletricamente carregados é convertido em uma corrente elétrica proporcional. A corrente então é processada por um sistema de dados que converte a informação, exibindo-a como um espectro de massa. Recentemente, essa técnica vem sendo cada vez mais desenvolvida na aplicação de análises de esteróides, tireoidianos, vitaminas, metabolômica, entre outros, tanto para exames de rotina quanto em projetos de pesquisa. O LC-MS/MS também é a técnica analítica de escolha para avaliação laboratorial das catecolaminas urinária e plasmática.

Quando combinados aos mecanismos de separação física do HPLC (cromatografia líquida de alta performance), a espectrometria de massa passa a receber a sigla de LC-MS. A utilização deste conjunto de tecnologias permite análises de alta especificidade e sensibilidade. O diferencial destes métodos combinados é determinar a "identidade digital" do analito para cada endocrinopatia que acomete cães e gatos. Dentre as principais vantagens deste método destacam-se o uso de pequeno volume de amostra, a possibilidade de medição de hormônios em concentrações relativamente baixas, o uso de uma biblioteca de padrões que permitem a medição simultânea de vários analitos.

O PMI - é um imunoensaio diagnóstico com micropartículas paramagnéticas que utiliza esferas magnéticas como marcador em vez de enzimas convencionais (ELISA), radioisótopos (RIA) ou moléculas fluorescentes (imunoensaios fluorescentes) para detectar um analito específico. O PMI envolve a ligação específica de um anticorpo ao seu antígeno, onde uma etiqueta magnética é conjugada a um elemento do par. A presença de esferas magnéticas é então detectada por um leitor magnético que mede a alteração do campo magnético induzida por essas esferas. O sinal medido é diretamente proporcional à concentração da substância alvo que queremos quantificar. As esferas magnéticas são feitas de partículas de óxido de ferro de tamanho nanométrico encapsuladas ou coladas juntamente com polímeros. As etiquetas magnéticas exibem várias características muito importantes, dentre elas, a turbidez ou a coloração da amostra não tem qualquer impacto nas propriedades magnéticas. E outra característica importante é que esse ensaio não sofre interferência da biotina na mensuração dos analitos alvos.

As enzimas são os marcadores mais utilizados na atualidade, certamente é por esse método que encontramos uma vasta oferta de conjuntos comerciais (kits) com uma ampla biblioteca de anticorpos, espécie específica para muitos animais principalmente cães, bovinos e roedores (animais de laboratório). Com a possibilidade da amplificação catalítica e da associação a outros marcadores, por exemplo, os quimioluminescentes e fluorescentes, resultando em ensaios de baixo limite de detecção.

Esse sistema de análise pode operar tanto em versão competitiva como não competitiva. Na versão competitiva, antígenos marcados com enzimas competem com antígenos livres (analito) por número limitado de anticorpos imobilizados. Atualmente, utilizam se, tanto para ensaios competitivos quanto não competitivos, sistemas que fazem, além de leitura automatizada dos diferentes poços, diluições em série e réplicas das amostras.